丙酮酸乙酯对D- 氨基半乳糖诱导的急性肝损伤大鼠的保护作用

丙酮酸乙酯对D- 氨基半乳糖诱导的急性肝损伤大鼠的保护作用
【摘要】目的观察丙酮酸乙酯（EP）对D-氨基半乳糖盐酸盐诱导的急性肝损伤模型大鼠的保护作用，并探
讨其作用机制。 方法制备D-氨基半乳糖盐酸盐诱导的急性肝损伤大鼠模型48 只， 并随机分成正常组、 模型
组、 小剂量EP 提前干预组、 大剂量EP 提前干预组、 小剂量EP治疗组和大剂量EP 治疗组。 在造模后24h 时
取血， 采用ELISA 法检测TNF-α、IFN-γ、IL-10 和IL-18 水平；采用RT-PCR 法检测肝组织HMGB1 mRNA
水平变化。结果与正常组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IFN-γ、IL-10和IL-18 水平均无明显变化（P跃
0.05），而肝组织HMGB1 mRNA水平明显升高（P<0.01）；与模型组比较，EP提前干预组和EP治疗组动物血
清TNF-α、IFN-γ、IL-10 和IL-18 水平均无明显变化，而EP 提前干预则显著降低了肝组织HMGB1 mRNA
水平（P<0. 01）， 其中大剂量组最为显著（P<0. 01） ； 病理学检查显示， EP 提前干预组大鼠肝组织学得到
明显改善，尤其是在大剂量组，而且比EP治疗组更加显著。结论EP能有效保护D-氨基半乳糖盐酸盐诱导的
大鼠急性肝损伤，保护效果与药物的干预剂量成正相关，并且提前干预的效果更明显。
【关键词】急性肝损伤；丙酮酸乙酯；高迁移率族蛋白B1；D-氨基半乳糖
The protective effect of ethyl pyruvate on acute hepatic injury induced by D-galactosamine
hydrochlorate inrats HE Canming， WANG Luwen， REN Qiaojing， et al. Department of Infectious Disease，
People’s Hospital，Wuhan Uni versity， Wuhan，430060，China
【Abstract】Objective To observe the protective effect of ethyl pyruvate （EP） on acute hepatic
injury induced byD-galactosamine hydrochlorate in ras. Methods The acute hepatic injury induced
by D-galactosamine hydrochlorate were
prepared in 48 male Wistar rats and the animals were divided at random into normal， model， early
interference of lowdose of EP， early interference of high dose of EP， low dose of EP treatment
and high dose of EP treatment groups. 24hours after modeling， the serum levels of TNF-α ， IFN-γ ，
IL-10 and IL-18 were assayed by ELISA， the changes of highmobility group box 1 protein（HMGB1）
mRNA in liver tissues were determined by RT-PCR， and the pathological changesof liver tissues
were detected by HE staining. Results The levels of HMGB1 mRNA in liver tissues of model rats
weresignificantly higher than normal group （P<0. 01） ， while serum levels of TNF-α ， IFN-γ ，
IL-10 and IL-18 in model grouphad no obvious changes （P>0. 05） . Compared with model group，
the levels of serum TNF-α ， IFN-γ ， IL-10 and IL-18 hadno obvious changes in EP early interference
group or in EP treatment group， but the HMGB1 mRNA levels in liver tissues in EP early interference
group were obviously decreased（P<0. 01） ， especially in high-dose group， which was more obvious
than in EP treatment group（P<0.01）. The histopathological changes in the livers was most
significantly improved inEP early interference， especially in high dose group. Conclusion Ethyl
pyruvate could protect effectively the acute liverinjury induced by D-galactosamine hydrochlorate
in rats， and the protective effect is shown as a dose-and time-dependentmanner.
【 Key words 】 Acute hepatic injury ； Ethyl pyruvate ； High mobility group box 1 protein ；
D-galactosamine
重型肝炎的发病机制存在“两次打击” 学说， 一是由病毒直接或通过免疫反应间接地导致原发性
损伤， 二是以内毒素-细胞因子轴- 肝损伤学说为核心的继发性损伤 [1] 。 研究显示， 重型肝炎患
者存在严重的肠道微生态失衡， 肠壁屏障功能受损， 导致肠道细菌移位 [2] 。 细菌移位可引起内毒
素血症及各种感染如自发性细菌性腹膜炎等。 高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1
protein， HMGB1） 是近年研究发现的一种强大的致炎细胞因子， 并可与IL-1、 IL-6 和TNF-α 等
重要炎症因子相互诱生。 HMGB1作为晚期炎症介质， 参与了内毒素血症的发生与发展过程 [3] 。 因
此， HMGB1 成为治疗炎症性疾病的重要靶物质 [4] ， 并为炎症性疾病开辟了一个新的研究领域。 本
研究应用D- 氨基半乳糖盐酸盐构建急性肝损伤大鼠模型， 观察血清HMGB1、TNF-α 、IFN-γ 、IL-10
和IL-18等细胞因子水平的变化， 并应用HMGB1 拮抗剂—丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate， EP） 进
行干预治疗， 探讨HMGB1在急性肝损伤发病机制中的作用， 以及HMGB1 拮抗剂对急性肝损伤大鼠
的保护作用。
材料与方法
一、 动物模型的制备将48 只雄性Wistar 大鼠（武汉大学医学部动物实验中心， 200～250g） 随
机分为六组， 每组8 只。 （1） 模型组： 大鼠禁食12 h后， 腹腔注射D-氨基半乳糖盐酸盐溶液（江
苏省启东市经贸有限公司） ， 剂量为1. 2g· kg -1 ， 制备急性肝损伤大鼠模型； （2） 正常组： 大
鼠腹腔注射等量的生理盐水； （3） 小剂量提前干预组： 在制备急性肝损伤大鼠模型前2h， 给予
大鼠腹腔注射EP液（Sigma 公司， 乳酸钠林格氏液配制： Na + 130mmol/L、K + 4mmol/L、Ca 2+ 2. 7mmol/L、
Cl - 139mmol/L、 EP 28mmol/L， pH=7. 02） ， 剂量为20mg· kg -1 ； （4） 大剂量提前干预组： 在造
模前2h， 给予大鼠腹腔注射EP 液， 剂量为40mg· Kg -1 ； （5） 小剂量治疗组： 在造模后2h， 给予
大鼠腹腔注射EP液， 剂量为20 mg· kg -1 ； （6） 大剂量治疗组： 在造模后2h， 给予大鼠腹腔注射
EP 液， 剂量为40 mg· kg -1 。 各组大鼠均在造模后24h时， 用10%水合氯醛麻醉动物， 行心脏采血，
分离血清， 于-70℃保存备检。 同时留取肝组织， 用10%甲醛溶液固定， 常规石蜡包埋， 切片， HE
染色， 在显微镜下观察组织形态学变化。
二、 血清细胞因子的检测采用ELISA法检测血清TNF-α 、 IFN-γ 、 IL-10 和IL-18 水平， 按试剂
盒（晶美生物工程有限公司） 说明书操作。
三、 肝组织HMGB1 mRNA 水平的检测采用RT-PCR 法， 取动物肝组织100mg 匀浆， 按Trizol 试剂
操作说明抽提肝组织RNA， 并逆转录成cDNA（RT 试剂盒购于日本TOYOBO 公司） 。 HMGB1 引物（667
bp） ： 上游5' -CTG ACA AGG CTC GTT ATG-3' ， 下游5' -TACCAG GCA AGG TTA GTG-3' 。 内参β -actin
（309 bp） ： 上游5' -TCA TGA AGT GTG ACG TGG ACA TC-3' ， 下游5' - CAG GAG GAG CAA TGA TCT
TGA TCT-3' 。 引物由上海英骏生物技术有限公司合成。 PCR 参数均为95℃预变性5min、 最后72℃
延伸10min。 中间循环条件为： HMGB1： 94℃ 60s、 51℃ 60s、 72℃ 80s， 40 个循环； β -actin：
94℃ 30s、 55℃ 30s、 72℃ 80s， 35 个循环。 2%琼脂糖凝胶电泳， 采用HPIAS2000 型图像分析
系统测定平均吸光度， 以各指标平均吸光度与内参照β -actin 的比值代表其mRNA相对水平。
四、 统计学处理所有数据都用SPSS13. 0 数据包分析， 计量资料用x±s 表示， 两组间比较用t 检
验， 多组间比较用方差分析， P<0. 05 为差异有统计学意义。
结果
一、 肝组织病理学变化正常组大鼠肝小叶结构完整， 肝细胞无变性坏死； 模型组大鼠肝小叶结构
消失， 周围有大量炎性细胞浸润， 肝索紊乱， 大量肝细胞肿胀， 核变大， 染色变浅， 核仁溶解，
提示存在急性肝组织损伤； 而与模型组比较， EP 提前干预组大鼠的肝组织学得到明显改善， 尤
其是在大剂量组， 表现为炎性细胞浸润明显较少， 肝索较整齐， 肝细胞体积肿大不明显， 核仁溶
解较少； EP 治疗组大鼠的肝组织学改善没有EP 提前干预组显著， 尤其是小剂量组， 仍然表现为
肝小叶结构不清， 大量炎性细胞浸润， 肝细胞肿大， 肝索结构不清， 胞核肿大， 核仁溶解较多（图
1） 。
二、 血清细胞因子的变化与正常组比较， 模型组大鼠血清TNF-α 、 IFN-γ 、 IL-10和IL-18 水平
均无明显变化（P＞0. 05） ； 与模型组比较， EP 提前干预组及EP 治疗组TNF-α 、 IFN-γ 和IL-10
水平均无明显变化（P＞0. 05） ， 大剂量EP 提前干预组及大剂量EP 治疗组IL-18 显著降低
（P<0. 05） ， 并且与同组小剂量组比较有统计学差异（P<0. 05） ； EP 提前干预组与EP 治疗组之
间比较， 血清TNF-α 、 IFN-γ 、 IL-10 和IL-18 水平均无明显差异（P＞0. 05） 。 三、 肝组织HMGB1
mRNA水平变化模型组大鼠肝组织HMGB1 mRNA 水平与正常组比较明显增高（P<0. 01） ； 与模型组
比， EP 提前干预组显著抑制了肝组织HMGB1 mRNA 的表达（P<0. 01） ， 其中大剂量组最为显著，
与正常组比较已无统计学差异（P>0. 05） ； 与模型组比较， EP治疗组亦抑制了肝组织HMGB1 mRNA
的表达（P<0. 05） ， 但没有EP提前干预组显著。 大剂量EP 提前干预组大鼠肝组织HMGB1 mRNA 的
表达低于大剂量治疗组（P<0. 05， 图2 和图3） 。
讨论
内毒素血症与肝损害互为因果， 对肝病的发生发展产生重要的影响。 据文献报道， 内毒素血症在
肝病中的发生率为： 重型肝炎64%～100%； 失代偿期肝硬化46. 5%～75. 9%； 代偿期肝硬化23. 5%；
急性病毒性肝炎36% [5] 。 由此可见， 内毒素血症在重型肝炎发病中起重要作用。 HMGB1作为晚期炎
症介质， 参与了内毒素血症的发生与发展过程 [3] 。 HMGB1 作为一种重要的炎症介质和致炎细胞因
子， 是启动和维持炎症瀑式反应的中心分子， 不仅自身分泌有级联放大效应， 而且还可以调节其
他炎症因子的分泌， 与内毒素血症、 肝炎、 关节炎、 急性肺炎和自身免疫性疾病等的发病机理关
系密切。 本研究应用D- 氨基半乳糖盐酸盐构建急性肝损伤大鼠模型， 观察了HMGB1、 TNF-α 、
IFN-γ 、 IL-10 和IL-18 等细胞因子水平的变化， 发现D- 氨基半乳糖盐酸盐诱导急性肝衰竭的
机制之一可能是增加了肝脏对来自肠道内毒素的敏感性 [6] 。 TNF-α 、 IFN-γ 、 IL-10和IL-18属于
早期炎症因子， 在急性炎症发生后其血清水平迅速升高， 约在3~6h 达高峰， 之后迅速下降， 在
12h 时即降至接近正常水平， 然后一直在较低水平维持至24h； 而HMGB1 作为晚期炎症介质， 其
水平在12h 开始明显升高， 至48h 仍维持在高水平 [7] 。 本研究结果发现， 造模后24h 时， 急性肝
损伤模型组大鼠血清TNF-α 、 IFN-γ 、 IL-10 和IL-18水平与正常组比较均无明显变化， 而肝组
织HMGB1 mRNA 水平则已明显升高， 提示TNF-α 、 IFN-γ 、 IL-10 和IL-18 作为早期炎症因子，
在急性肝损伤造模后24h 时已恢复到正常水平； 在炎症过程中， HMGB1 的出现明显晚于TNF-α 和
白细胞介素， 预示着HMGB1的靶向治疗即使在急性炎症的较晚阶段才开始， 也能发挥某种作用。
本研究进一步应用HMGB1 拮抗剂EP 对D- 氨基半乳糖盐酸盐诱导的急性肝衰竭大鼠进行了干预
治疗， 并观察到EP 的保护作用。 EP 是一种稳定的亲脂性丙酮酸衍生物， 能通过降解谷胱甘肽成
为二硫化物， 使细胞内氧化还原状态发生改变， 从而抑制NF-κ B 的转位以及p38 丝裂原活化蛋
白激酶的信号转导， 并且抑制炎性介质的释放 [8] 。 本研究结果显示： EP 提前干预显著降低了急
性肝损伤大鼠肝组织HMGB1mRNA 水平， 而且EP 提前干预比造模后2h 给予EP 治疗更有效。 肝组
织病理学检查亦显示： EP提前干预组大鼠肝组织学得到明显的改善。 EP治疗组大鼠肝组织学改善
没有EP 提前干预组显著， 提示EP 能有效地保护D-氨基半乳糖盐酸盐诱导的大鼠急性肝损伤， 保
护效果与药物的干预剂量成正相关， 并且提前干预的效果更明显。
参考文献
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酒精性脂肪肝大鼠肝组织骨桥蛋白表达的变
化
江志奎胡超杰刘超何苇朱华庆周青汪渊
【摘要】 目的探讨乙醇联合高脂饮食诱导脂肪肝大鼠肝组织骨桥蛋白（OPN） 表达的变化。 方法采用高脂饮
食联合乙醇灌胃制备大鼠脂肪肝模型。 在第6 周末分别取血和肝组织， 常规检测血生化指标和采用Western
blot 法检测大鼠肝组织骨桥蛋白表达的改变。 结果乙醇联合高脂饮食条件下大鼠血清ALT、 AST、 TG、 TC
水平升高（P<0. 05） ， HDL-C降低（P<0. 05） ； 油红O染色结果显示乙醇联合高脂饮食组大鼠肝脏脂肪变明
显； 模型组大鼠肝组织OPN蛋白表达明显增强（P<0. 05） 。 结论骨桥蛋白表达增强在大鼠乙醇性脂肪肝的发
病过程中起一定的作用。
【关键词】 酒精性脂肪肝； 骨桥蛋白； 大鼠
The expression of osteopontin in the liver of rats with alcoholic fatty liver JIANG Zhikui，
HU Chaojie， LIU Chao， et al. Laboratory， 105th Hospital of PLA， Hefei 230031
【Abstract】 Objective To investigate the expression of osteopontin in the liver of rats with
alcoholic fatty liver. Methods SD rats were treated with high fatty diet in combination with ethanol
intake for 6 weeks to establish the mod el of alcoholic fatty liver. By the end of the 6th week，
all rats were sacrificed， and the levels of ALT， AST， TG， TC， HDL-Cin sera was measured respectively，
and the slides of liver were stained with oil red O and observed by microscope. Theexpressions
of osteopontin were detected by Western blot. Results Serum levels of ALT， AST， TG， TC in model
groups increased significantly compared with controls （P<0. 05）； the liver histological examination
demonstrated the apparent fat accumulation in liver of rats with alcohol treatment. When combined
with high fatty diet， ethanol could significantly improvethe expression of osteopontin（P<0. 05） .
Conclusion The increased expression of osteopontin might play a role in thepathogenesis of
alcolhol-induced fatty liver.
【Key Words】 Fatty liver； Osteopontin； Ethanol； Rats
嗜酒所导致的酒精性肝病严重威胁着人类的健康。 在美国， 每年死于酒精性肝病的人数居于各类
疾病死亡人数的前10位， 每年用于酒精性肝病相关的研究和防治费用高达1100亿美元。 近年来，
临床研究表明， 酒精性肝病在我国的流行状况不容忽视。 乙醇对肝脏的损伤主要分为三个阶段，
即酒精性脂肪肝、 酒精性肝炎和酒精性肝硬化。 其中酒精性脂肪肝是酒精性肝损害的早期病变，
也是乙醇中毒最常见的肝脏病变， 表现为肝脏内广泛的脂肪堆积并伴有轻到中度的肝功能损伤。
虽然酒精性脂肪肝被认为是一种良性病变且为可逆性的， 但是脂肪堆积的肝脏更易受到乙醇诱导
的氧化压力、 自由基及其他因素的进一步损伤， 可发展成酒精性肝炎和肝硬化。 因此， 探寻酒精
性脂肪变的发病机制对于酒精性肝病的防治具有十分重要的作用。 骨桥蛋白（Osteopontin， OPN）
是一种磷酸化糖蛋白， 在正常组织中分布广泛但表达量很少， 与炎症、 癌转移、 心血管疾病、 肥
胖、 成骨等病理生理过程相关， 能作为NKT 细胞的介质， 参与T 细胞介导的肝脏疾病 [1、 2] 。 目前，
OPN在乙醇性脂肪肝形成过程中的变化报道较少。 本研究采用高脂饮食联合乙醇灌胃制备大鼠乙
醇性脂肪肝模型， 探讨酒精性脂肪肝大鼠肝组织OPN 蛋白表达水平的变化， 为进一步研究酒精性
脂肪肝的发病机制提供实验依据。
材料与方法
一、 实验动物及主要试剂普通级雄性SD 大鼠20只， 体质量180～200g， 由安徽医科大学实验动物
中心提供； 市售56度（v/v） 红星二锅头白酒由北京红星股份有限公司生产； 油红O 为上海沃凯
生物公司产品； 抗OPN 抗体购自Sigma 公司； 血清生化指标测定试剂盒为德国CENTRONIC 公司产
品； 增强化学发光（Enhanced chemiluminescence， ECL）试剂盒（Supersignal West Pico TrialKit）
购于PIERCE公司。
二、 酒精性脂肪肝大鼠模型的制备随机将大鼠分为A、 B、 C和D组， 每组5 只。 A组为正常对照组，
在室温及稳定湿度条件下， 给予全价颗粒饲料喂养， 每日予以生理盐水10mg· kg -1 分2 次灌胃；
B 组为高脂饮食组， 给予包括胆固醇2%、 猪油10%、 基础饲料88%的饲料， 同时每日予以生理盐水
10mg·kg -1 分2 次灌胃； C组为小剂量乙醇灌胃+ 高脂饮食组， 给予56 度（v/v） 白酒5ml·kg -1 ·d -1
分2 次灌胃， 并喂高脂饲料（配方同上） ； D 组为大剂量乙醇合并高脂饮食组， 给予56度（v/v）
白酒10ml· kg -1 · d -1 分2 次灌胃 [3] 。 于第6 周末， 所有大鼠禁食12h， 乙醚麻醉后， 称体重， 心
脏穿刺取血， 制备血清于-80℃冰箱保存备用。 解剖获取全部肝脏并称取重量， 以肝脏重量除以
大鼠体重计算肝体比指数。 取部分肝组织用Optimum cuttingtemperature（OCT） 冰冻切片包埋
剂包埋， 冰冻切片， 置于预先配置好的油红染液中10～15min， 60%乙醇分色， 自来水冲洗， 在Harris
苏木精染液中淡染30s， 自来水冲洗至变蓝， 室温中放置稍干， 中性树胶封片， 显微镜下观察并
拍照； 部分肝组织置甲醛中固定， 石蜡包埋、 切片； 另取肝组织置液氮中保存备用。
三、 血生化指标的检测采用全自动生化分析仪（HITACHI 7600） 检测血生化指标。
四、 肝组织OPN 表达的检测采用Western blot法。 取-80℃保存的肝组织， 预冷PBS 冲洗残留血
迹， 加入RIPA 缓冲液（150mmol/L NaCl， 1% NP-40， 0. 5% deoxycholicacid， 0. 1% SDS， 2mmol/L
EDTA， 50 mmol/LTris， pH8. 0） 匀浆， 抽提蛋白， 采用BCA 法进行蛋白定量， 加入上样缓冲液后，
进行SDS-PAGE 电泳， 将蛋白转移到PVDF 膜， 丽春红S 染色， 用含5%脱脂奶粉的PBS 封闭2h， 加
入抗OPN 抗体， 4℃孵育过夜， PBS 洗膜， 加入相应的HRP 标记的抗小鼠和抗兔IgG， 37℃孵育3h，
ECL显色， 应用Image-Pro plus 图像处理系统对Western blot图像进行处理， 对实验结果进行半
定量分析。
五、 统计学处理计量资料以x±s 表示。 应用SPSS 13. 0统计学软件进行组间资料的析因方差分析。
结果
一、 一般情况脂肪肝大鼠较对照组动物食欲减退， 嗜睡。 6周后体重减轻。 对照组、 高脂饮食组、
高脂饮食加低剂量乙醇组、 高脂饮食加高剂量乙醇组肝体比指数分别为0. 026±0. 008、 0. 029±
0. 009、 0. 033±0. 011、 0. 034±0. 003。 脂肪肝大鼠肝体比指数较对照组升高（P<0. 05） 。
二、 酒精性脂肪肝大鼠血生化指标的变化脂肪肝大鼠血清ALT 和AST 活性明显高于对照组， 低剂
量和高剂量处理组动物血清ALT 活性低于高脂饮食组； 脂肪肝大鼠血清TG 和TC 浓度高于对照
组， 而HDL-C 水平呈明显下降趋势（表1） 。
三、 肝组织病理学变化的比较经油红O染色的肝组织在镜下显示， 脂肪肝大鼠肝内脂肪堆积明显，
且随着乙醇剂量的增加， 肝脂肪变程度加重（图1） ， 表现为肝细胞内脂肪颗粒明显增多。 四、
大鼠肝组织OPN 蛋白表达的变化应用Image-Pro plus 图像处理系统对Western blot 图像进行处
理， 对实验结果进行半定量分析。 以对照组为基数1， 脂肪肝大鼠、 小剂量乙醇喂养大鼠和大剂
量乙醇喂养大鼠OPN/茁-actin 比值分别为1. 08依0. 19、 2. 21依0. 22和2. 19依0. 25， 大、 小剂量
乙醇喂养大鼠OPN 表达显著增强（P<0. 05， 图2） 。
讨论
高脂饮食引起的高血脂、 动脉粥样硬化、 冠心病等严重威胁着人类的健康。 流行病学证明饮酒更
进一步加重病变的进程。 探讨两者联合作用诱发的肝脏脂肪病变无疑具有重要的意义。 作为酒精
性肝病的早期病变， 酒精性脂肪肝虽然具有可逆性， 但大量研究证明脂肪化的肝细胞更容易受到
乙醇、 氧化压力、 内毒素、 药物等因素的“二次打击” ， 从而导致病情的进一步发展， 即酒精性
脂肪肝→酒精性肝炎→酒精性肝硬化→肝癌 [5] 。 本实验表明， 高脂饮食联合不同剂量乙醇灌胃构
建大鼠乙醇性脂肪肝模型6 周后， 模型组动物肝体指数较对照组明显升高， 血清ALT、 AST、 TG、
TC 含量明显增高。 肝脏呈现明显的脂肪颗粒， 提示乙醇联合高脂饮食能够进一步诱导大鼠肝脏
内脂肪的堆积， 加重肝脏脂肪变的进程。 模型组HDL-C水平呈明显下降趋势， 这与肝功能受损，
肝脏合成HDL 减少， 导致胆固醇的逆向转运明显减弱有关， 也与体内总胆固醇升高相吻合。 脂肪
肝的发生取决于肝脏脂质的摄入（TG 的摄取、 脂肪酸的合成及酯化） 和输出（脂肪酸的氧化和
TG的外运） 是否平衡。 当肝脏的摄入超过输出时， 肝脏内脂肪大量堆积， 发生脂肪变性 [6] 。 综合
以上实验数据， 本试验成功制备了大鼠酒精性脂肪肝模型 [7] 。
人的OPN基因定位在染色体4q13， 小鼠位于5号染色体上。 OPN的相对分子质量约44kd， 约含300 个
氨基酸残基 [8、 9] 。 OPN 功能上具有细胞因子的特点， 参与炎症与免疫反应、 组织修复、 血管生成
与创面愈合、 骨质矿化等作用 [10、 11] 。 OPN在多种疾病的发生、 发展中起着重要的作用。 近年研究
发现OPN与肝脏疾病的关系密切 [12～18] 。 本实验研究表明， 在酒精性脂肪肝大鼠肝脏OPN 的表达明
显增强， 而在单纯性高脂组动物肝组织OPN 的表达无明显变化， 表明OPN 的表达增强与乙醇及其
代谢产物的作用相关。
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白黎芦醇对肝纤维化大鼠肝组织E- 钙
粘附素表达的干预作用 *
万荣伍建业刘珺权鹤鸣牛培勤王兴鹏郭传勇
【摘要】目的研究E-钙粘附素在不同肝纤维化阶段的表达情况以及在抗肝纤维化中药单体白黎芦醇干预下
表达的变化。 方法制备大鼠肝纤维化模型， 分别给予小（40mg·kg -1 ） 、 中（120mg·kg -1 ） 和大剂量（200mg·kg -1 ）
白黎芦醇处理，取肝组织检测E-钙粘附素、 转化生长因子茁（TGF-β ） 、 基质金属蛋白酶抑制因子（TIMP-1）
1 mRNA 水平； 采用放射免疫法检测血清HA和pc芋水平。 结果正常组大鼠肝组织E-钙粘附素呈低水平（0. 515
依0.02） 表达， 而随着肝纤维化的进展， 其水平增加， 其中在12 周时， 肝组织E-钙粘附素m RNA水平（0. 878
依0.03） 明显高于中剂量（0. 755依0. 24） 和大剂量白黎芦醇处理组（0. 763依0. 21， P <0. 01） ； 在大鼠肝
纤维化进展过程中， 肝组织TIMP-1 和TGF-β mRNA水平不断增加。 结论E-钙粘附素在不同阶段肝纤维化大鼠
肝组织均有表达，且随着纤维化程度的加重而表达增强。白黎芦醇可以明显改善大鼠肝纤维化程度，并减
少E-钙粘附素mRNA 水平。
【关键词】肝纤维化；白黎芦醇；E-钙粘附素；转化生长因子-β ； 基质金属蛋白酶抑制因子1；大鼠
Inhibition of resveratrol， a herbal medicine， on expression of E-cadherin in hepatic tissues of
rats with CCl 4- induced fibrosis WAN Rong， WU Jianye，LIU Jun， et al. Department of Gastroenterology，
Tenth People’s Hospital，Affiliated to Tongji University， Shanghai 200072，China
【Abstract】Objective The aim of this study was to explore the effect of resveratrol， a herbal
medicine， on expression of E-cadherin in hepatic tissues of rats with CCl 4- induced fibrosis. Method
Hepatic fibrosis model in rats wasprepared， with the intragastric administration of resveratrol
at low， middle and large doses. E-cadherin， TGF-β and TIMP-1mRNA in different stages of hepatic
fibrosis were determined by using RT-PCR. The serum HA and precollagen III lelveswere determined
by radioimmunoassay. Result E-cadherin mRNA in normal rats（0.515±0. 02） was low and steady，
whileit increased in rats with hepatic fibrosis. The E-cadherin mRNA level at week 12 in rats
with fibrosis （0. 878±0. 03） washigher than in with resveratrol intervention （in middle dose
was 0. 755±0. 24 and in large 0. 763±0. 21， respectively， both P<0. 01） ； The changes of TGF-β and
TIMP-1 mRNA were as the same manner as E-cadherin. Conclusion Resveratrolhas an inhibitory effect
on hepatic fibrosis， maybe by decreasing the intrahepatic E-cadherin mRNA levels.
【Key words】 Liver fibrosis； Resveratrol；E-cadherin；Rat
目前认为， 肝纤维化过程是肝星状细胞（Hepaticsatellite cell， HSC） 在各种损肝因素持续刺
激下被“激活” ， 并大量合成细胞外基质（extracellular matrix， ECM） 在肝内沉积， 引起肝
小叶结构改变的病理过程 [1， 2] 。 随着对肝纤维化发生机制认识的深入， 黏附分子在肝纤维化中
的作用越来越受到重视， 无论 HSC 的激活、 凋亡， 还是 HSC 与 ECM 的相互作用都与黏附分子密
切相关 [3] 。 因此， 黏附分子可能作为诊断和治疗肝纤维化的新靶点。 E-钙粘附素（E-cadherin）
作为黏附分子中的重要一员， 在肿瘤转移方面的作用研究较多 [4] ， 而其在肝纤维化及其与 HSC 的
关系研究报道甚少。 由于 E-cadherin 的一些作用可能是通过细胞因子如基质金属蛋白酶抑制因
子（TIMP-1） 、 转化生长因子-β （TGF-β ） 等而实现的 [4～6] ， 因此本实验研究了 E-cadherin、
TIMP-1 和 TGF-β 在肝纤维化过程中的表达情况， 并观察了中药单体白黎芦醇治疗后对大鼠肝
纤维化的干预作用， 以进一步了解白黎芦醇的抗肝纤维化作用。
材料与方法
一、 动物和试剂雄性SD大鼠125 只， 体重250±50g， 由中国科学院上海动物实验中心提供； 中药
单体白黎芦醇购于上海纳贝生物技术有限责任公司。 用于总RNA 提取的Trizol 试剂盒购自
Intivigen 公司。 两步法RT-PCR 试剂盒（AMV） Ver3. 0 购自日本TAKARA 公司。 E- 钙粘附素mRNA
原位杂交试剂盒（MK1181b） 、 TGF-β mRNA 原位杂交试剂盒和大鼠TIMP-1 ELISA试剂盒（EK0583）
购自武汉博士德生物工程有限公司。
二、 大鼠肝纤维化模型的制备将125 只大鼠随机分为正常对照组、 模型组、 小剂量、 中剂量和大
剂量白黎芦醇干预组， 每组25 只。 用液体石蜡将CCl 4 配成40%的溶液， 按0. 75ml· 100g -1 给动物
皮下注射， 每周3 次， 共8wk。 模型组动物在造模的同时， 将白黎芦醇分别用无菌蒸馏水稀释为
10mg/ml、 30mg/ml 和50mg/ml， 分别给大鼠按40mg· kg -1 、 120mg· kg -1 和200mg· kg -1 灌胃， 1 次
/ 日， 共13 周。 分别于造模后4w、 6w、 8w、 10w和12w末取肝组织（1cm×1cm×1cm） ， 经4%中性
缓冲甲醛固定， 石蜡包埋， 切片， 行HE和VG染色， 在光镜下观察肝组织病理学改变。 另取肝组织
-70℃冻存。
三、 血清学检测透明质酸（Haluronic acid、 HA） ， Ⅲ型前胶原（PCⅢ） 放射免疫试剂盒购于中
国上海钰森公司。 肝功能检测用全自动生化分析仪测定血清谷丙转氨酶（ALT） ， 白蛋白（ALB） ，
由我院检验科协作检测。
四、 大鼠肝组织E-cadherin、 TIMP-1、 TGF-β mRNA检测采用两步RT-PCR 法行半定量检测。 大鼠
E-cadherin 扩增引物： 正义链： 5’ -TTG ATG CCA GACCGGAAG TG-3’ ， 反义链： 5’ -TTC TTC GCC
GCCACC ATA C-3’ ， 扩增片断长度为317bp； TIMP-1扩增引物： 正义链： 5’ -ATA TTC TGT CTG GAT
CGG C-3’ ， 反义链： 5’ -GCT TCG TCA TAC TCC TGT TT-3’ ； TGF-β 扩增引物： 正义链： 5’ -TAA
TGG TGG ACCGCA ACA ACG- 3’ ， 反义链： 5' - CTT GCT GTA CTGTGT GTC CAG-3’ ' 。 以GAPDH为
内参照， 扩增引物： 正义链： 5’ -TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA-3’ ， 反义链： 5’ -AGA TCC ACA
ACG GAT ACA TT-3’ 。 扩增产物长度为309bp。 各组RT-PCR产物经电泳后， 采用天能GIS-1000 数
码凝胶摄影系统拍照， 测定各条带的吸光度值， 对RT-PCR产物进行半定量分析， 以每一条带与其
相对应的参照GAPDH 条带吸光度比值作为衡量各组不同标本间表达差异的最终指标， 避免因所提
取RNA 标本浓度差异而引起的误差。
结果
一、 病理学表现在第12 周时， 除正常对照组外， 各组动物均有不同程度的肝纤维化表现， 其中
以模型对照组和小剂量组最明显， 而中剂量和大剂量药物干预组动物肝组织肝细胞再生和肝小叶
重建明显。
二、 白藜芦醇对大鼠肝功能的影响从表1 可见， 中剂量和大剂量白藜芦醇干预组肝纤维化大鼠血
清ALT水平明显低于模型对照组和低剂量干预组（P<0. 01） ， 提示白藜芦醇在120mg· kg -1 剂量下
可以明显改善肝脏炎症程度。 在第6周时中剂量和大剂量白藜芦醇干预组肝纤维化大鼠血清ALB
水平与模型对照组和低剂量组相比有差异， 但是无统计学显著意义（P<0. 05） ； 但是随着治疗时
间延长至第12周时， 这一差异变得显著（P<0. 01） ， 说明随着疗程的延长， 白藜芦醇在120mg·kg -1
剂量下有明显的改善肝功能的作用。
三、 白藜芦醇对肝纤维化大鼠血清HA 和pcⅢ水平的影响从表2 可见， 中剂量和大剂量白藜芦醇
干预组肝纤维化大鼠血清HA 和pcⅢ水平明显低于模型对照组和低剂量处理组（P<0. 01） ， 提示
白藜芦醇在120mg· kg -1 剂量下可以明显改善肝脏纤维化程度。
四、 大鼠肝组织E- 钙粘附素、 TIMP-1 和TGF-β 的变化见表3～4。 正常对照组动物肝组织E- 钙
粘附素呈低水平稳定表达； 各组肝纤维化大鼠随着肝纤维化的进展， 肝组织E- 钙粘附素mRNA 增
加。 在第12 周TGF-β 表达达到高峰， 而中剂量和大剂量药物处理组肝内TGF-β 和TIMP-1 mRNA
水平显著低于模型组和低剂量处理组（P<0. 01） ， 提示白藜芦醇在120mg· kg -1 剂量下可以减少
促肝纤维化因子的表达。
讨论
肝细胞的退行性病变， 不论是可逆的还是不可逆的， 均可通过局部各种递质的释放引起炎症反应，
后者通过旁分泌和（或） 自分泌途径刺激HSC 的激活， 最终促进肝纤维化的发生、 发展。 在此过
程中， 黏附分子起着重要的作用 [5， 6] 。 抗黏附治疗可以减轻肝损伤。 目前已发现的黏附分子主要
分五类： 免疫球蛋白超家族、 整合素家族、 选择素家族、 钙粘附素（Cadherin） 家族及其他未分
类的黏附分子。 其中研究最多的是免疫球蛋白超家族和整合素家族。 钙黏附素最早由Takeichi [6]
发现， 现已知Cadherin 家族共有3个成员： E-Cadherin、 N-Cadherin 和P-Cadherin。 E-Cadherin
也被称作Uvomorulin、 L-CAM 或Cell-CAM120/80。 不同的Cadherin 分子在体内有其独特的组织
分布， 它们的表达随细胞生长、 发育状态不同而改变。 Cadherin 分子以其独特的方式相互作用，
其配体是与自身的Cadherin分子相同。 目前， E-Cadherin 的研究主要集中在肿瘤转移方面 [7] ，
而与肝纤维化及HSC 的关系研究所见文献报道甚少。
本实验发现， 静息的HSC 呈低水平表达E-Cadherin， 而活化的HSC其E-Cadherin 基因及其表达产
物均增加。 另外， 模型组大鼠肝组织E-Cadherin 表达较正常组明显增加， 除肝窦周细胞、 血管
内皮细胞表达增强外， 肝细胞也出现阳性表达， 从细胞水平提示E-Cadherin 的表达与HSC的活化
和肝纤维化的发生密切相关。 在肝纤维化中， E-Cadherin 可能的主要作用一方面是介导了各种
肝脏细胞与ECM之间的相互作用和相互影响 [8，9] ； 另一方面， E-Cadherin 所调控的信号蛋白也参
与了生长因子受体激活后的信号转导通路 [10] 。 炎症细胞也可通过E-Cadherin 或其他黏附分子结
合而介导肝细胞和窦周细胞损伤而致纤维化。
白藜芦醇为无色针状结晶， 有四种存在形式， 即顺式白藜芦醇、 反式白藜芦醇、 顺式白藜芦醇苷
和反式白藜芦醇苷。 后两种形式在肠道中可被糖苷酶分解释放出白藜芦醇， 发挥其药理作用 [11] 。
目前， 研究表明它具有抗肿瘤、 抗心血管疾病、 抗突变、 抗氧化、 抗菌抗炎、 保肝、 抗肝纤维化、
诱导细胞凋亡及雌激素调节等广泛的生物学和药理学活性。 白藜芦醇抗肝纤维化的作用机理包
括： ①对脂质过氧化有很强的抑制作用， 能降低血清和肝脏的脂质， 减少脂质过氧化物在体内的
堆积， 保护肝脏不受损害； ②具有类雌激素样作用， 可以保护肝细胞膜， 减轻细胞损
伤。 黄兆胜等 [12] 研究发现白藜芦醇甙对四氯化碳（CCl 4 ） 损伤原代培养大鼠肝细胞有保护作用；
③能诱导肝成纤维细胞表型的改变， 显著减少成纤维细胞的增殖。 同时减少Ⅰ 型胶原蛋白的表达
和金属蛋白酶-9 的分泌， 对肝纤维化和肝癌的治疗有重要的意义 [13] 。 另外， 白藜芦醇还能通过
选择性下调细胞周期蛋白（cyclin） D1 的表达， 使星状细胞静止在G1 期 [14] ， 从而有利于抑制
肝纤维化的形成。 吕秋军等 [14] 实验观察白藜芦醇对CCl 4 致慢性肝纤维化大鼠有明显的治疗作用。
本研究发现在白藜芦醇干预下， E-钙粘附素表达减少； 而E-钙粘附素表达的减少或许又导致
TGF-β 受体数量和TIMP 表达的减少， 从而减轻或者抑制肝纤维化的进展。 随着对肝纤维化机制
认识的深入， E- 钙粘附素在肝纤维化过程中所起的作用越来越受到重视。 E-钙粘附素有可能作
为诊断肝纤维化程度、评估抗纤维化治疗疗效的一个指标， 同时也是治疗肝纤维化的新的靶位点。
而中药单体白黎芦醇因其丰富的药理作用而渐渐为人们所重视， 有希望成为抗肝纤维化治疗的新
药 [15] 。
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3-溴丙酮酸对SMMC-7721 肝癌细胞增殖的抑
制作用
邹满意陆伟罗雁王凤梅钱绍诚徐瑞成
【摘要】目的观察3-溴丙酮酸（3-BrPA）对SMMC-7721 肝癌细胞增殖的抑制作用。方法对经0.25mmol/L耀
8.00mmol/L 3-BrPA 溶液处理的SMMC-7721 细胞，采用MTT 法检测细胞增殖抑制情况，并在荧光显微镜和
电镜下观察细胞内部结构的变化。结果3-BrPA 对SMMC-7721 细胞的增殖有明显的抑制作用， 其中在
0.75mmol/L 浓度下的抑制作用最强； 经处理后的细胞， 在荧光染色下显示坏死细胞增多， 在电镜下显示细
胞染色质分散，少量核染色质凝聚。结论3-BrPA对SMMC-7721 肝癌细胞有抑制作用。
【关键词】SMMC-7721 肝癌细胞；3-溴丙酮酸；增生
Inhibition of three-bromopyruvate on proliferation of SMMC-7721 hepatoma cells in vitro ZOU Manyi，
LUWei， LUO Yan， et al. Department of Internal Medicine， Haihe Hosptial， Tianjin 300350， China
【Abstract】Objective To observe the inhibitory effect of 3-bromopyruvate on the cell
proliferation of SMMC-7721human liver cancer cell line. Methods The SMMC-7721 cells were treated
with different concentrations of 3-bromopyruvate， then the cell growth was assessed by MTT and
the apoptotic or necrotic cell death was examined by fluorescentstaining and by electron
microscopy. Results The 3-bromopyruvate at dose of 0. 75mmol/L inbibited SMMC-7721
cellproliferation； The necrotic cells were observed by fluorescent staining and the apoptotic
cells observed under electron microscope. Conclusion 3-bromopyruvate could inhibit the
proliferation of SMMMC-7721 cells.
【Key words】 SMMC-7721 hepatoma cells； 3-bromopyruvate；Proliferation
有研究发现肝癌细胞的糖酵解能力比正常肝细胞显著增强 [1] ， 其原因与糖酵解相关的酶活性增强
有关 [2] 。 作为己糖激酶（HK） 特异性抑制剂的3-溴丙酮酸（3-BrPA） 能够抑制肿瘤细胞的糖酵解
和氧化磷酸化过程， 使肿瘤细胞因ATP 供应不足而死亡 [3] 。 国外研究发现3-BrPA 对体外培养的
AS-30D 肝癌细胞有很强的抑制作用 [4] ， 但有关3-BrPA 对SMMC-7721 肝癌细胞的作用研究国内外
尚未见报道。 本文观察了3-BrPA 对SMMC-7721肝癌细胞的抑制作用， 以期为进一步研究其抗肿瘤
活性提供依据。
材料与方法
一、 细胞及试剂人肝癌SMMC-7721 细胞株细胞由天津武警医学院生物教研室馈赠； 用电子分析天
平精确称取3-BrPA 10. 2mg， 溶于5. 5ml 磷酸盐缓冲液（PBS） 中， 用0. 5ml 5. 6%NaHCO3 溶液调
PH 值至6. 8， 配制成10mmol/L 的母液， 用孔径0. 22μ m 的滤器过滤除菌， 经HDMEM 培养液稀释
后备用， 每次使用均为新鲜配制。
二、 细胞培养和传代取出冻存管， 迅速置于37℃～40℃水浴中， 使其在1min内解冻。 在无菌条件
下， 打开冻存管， 将冻存液和细胞移入无菌离心管中， 离心后弃上清液， 加入新鲜培养基， 混匀，
将细胞悬液转移到培养瓶中， 置于培养箱（37℃， 5%CO 2 ） 中培养， 贴壁后更换培养
液， 至细胞长成单层后， 加0. 25%胰酶2ml 与EDTA 1： 1混合， 消化后制成细胞悬液分装， 置于培
养箱内， 待完全贴壁后进行实验。
三、 细胞增殖的测定细胞经消化后， 调整细胞数为6×10 4 /ml， 接种在96 孔板（0. 1ml/ 孔） ，
待细胞贴壁后， 加（在0. 25～8. 0mmol/L之间6个不同浓度的）3-BrPA， 培养72h 后加入MTT （5mg/ml，
20μ l/ 孔） ， 37℃温箱中孵育4h， 离心， 弃上清液， 每孔加DMSO 200μ l， 恒温（30℃） 振荡10min，
将96孔板放置在酶标仪上测定570nm处的吸光度（OD） 值。 设对照组（未加药） 和空白对照组（只
含培养液） ， 每组处理均设8 个复孔； 调整细胞数为4. 5×10 4 /ml， 加入0. 25～2. 00mmol/L 之间
6 个不同浓度的3-BrPA， 培养24h、 48h 和72h， 检测细胞增殖抑制率。 细胞增殖抑制率＝（对照
组平均OD 值－实验组平均OD 值） ／ 对照组平均OD值×100%
四、 培养细胞形态的荧光检查采用荧光双染色法。 称取Hoechst33342 和PI 各1mg， 分别溶于10ml
DMSO和PBS 中使之配成100μ g/ml 的储备液， 用前将两者等量混合。 取SMMC-7721 细胞， 加
0. 75mmol/L 3-BrPA 溶液作用72h， 消化收集细胞于离心管中， 加200μ l PBS吹匀后转入
Eppendorff 管内， 再加Hoechest33342 至终浓度为10μ g/ml 和PI 50μ g/ml， 在37℃下染色
10min。 取40μ l 细胞悬液迅速滴在载玻片上加盖玻片， 在荧光显微镜（NIKON E800， 荧光波长
380-420nm） 下观察细胞的染色情况。
五、 电镜观察常规消化细胞后， 按1×10 6 /ml 接种细胞在培养瓶内， 贴壁后加3mmol/L 3-BrPA
溶液， 24h后弃上清液， 加PBS反复洗涤后， 加戊二醛固定液原位固定细胞后刮取细胞（以上操作
均在4℃下进行） ， 然后离心收集细胞， 按常规电镜标本制作程序处理标本， 在JEOL JEM-1010 型
透射电镜下观察细胞内部结构的变化。
六、 统计学分析所有数据均采用x±s 表示， 采用SPSS12. 0软件进行单因素方差分析， P＜0. 05 被
认为有统计学意义。
结果
一、 3-BrPA 抑制SMMC-7721 细胞增殖当细胞数为6×10 4 /ml 时， 1mmol/L 3-BrPA 对细胞的抑制
率最高， 当药物浓度大于1mmol/L 时， 则抑制率随浓度升高而下降（表1） 。
二、 3-BrPA 作用不同时间对细胞的抑制率比较见表2。
三、 Hoechst33342/PI 双荧光染色结果经3-BrPA处理后的细胞呈红色荧光， 有些细胞染色质凝聚
呈蓝色荧光， 即为典型的凋亡细胞； 未经药物处理的细胞核染色质呈均匀的蓝色荧光（图1、 2） 。
四、 超微结构观察在电镜下观察， 正常的SMMC-7721 细胞胞浆内可见髓样小体、 核蛋白体和粗面
内质网， 胞核内染色分布不均（图3） ； 经3-BrPA 处理后的细胞胞浆内细胞器结构不清， 可见粘
液样空腔， 胞浆内结构呈蜕变样坏死， 核膜不完整， 膜间隙增宽， 见少量凝聚的异染色质（图4） 。
讨论
正常肝组织的能量约99%来自糖的氧化， 糖酵解仅占1%， 但在肝癌组织中糖酵解明显增强， 占能
量供给的50% [5] 。 进一步研究证实肝癌组织糖酵解的增强是由于糖酵解过程中的几个关键酶， 如
HK和丙酮酸激酶的活性显著升高 [2] ， 其中HK的过度表达与糖酵解的增强尤为相关。 HK是糖酵解过
程中的第一个限速酶， 能催化葡萄糖磷酸化， 生成6-磷酸葡萄糖， 它的高表达对于维持肝癌细胞
高糖酵解表型是必需的 [6， 7] 。 做为强烷化剂的3-BrPA [8] ， 能与HK 活性部位的-XH 基结合， 抑制
酶活性 [9] ， 从而阻断肿瘤细胞的糖酵解过程， 使肿瘤细胞因能量供应缺乏而死亡。
本研究发现3-BrPA 对SMMC-7721 细胞增殖有抑制作用， 发现3-BrPA 在0. 75mmol/L 浓度时的抑
制作用最强。 Gwak 等 [10] 在研究中发现3-BrPA 能抑制Huh-BAT、 HepG2 和SUN-47 三种人肝癌细
胞在缺氧条件下的生长， 在3-BrPA 作用后的Huh-BAT细胞经荧光染色发现细胞呈凋亡改变。 本实
验应用Hoechst33342/PI 荧光染色， 发现经3-BrPA 处理后的细胞多被染成红色， 且染色质呈非
凝集状态。 根据荧光双染原理 [3] 、 可推测细胞是以坏死的方式而死亡的。 电镜检查结果显示细胞
经3-BrPA处理后， 胞浆内结构呈蜕变样坏死， 核膜不完整， 膜间隙增宽， 断续的核膜处可见少量
凝集的异染色质， 而细胞凋亡变化不明显。
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慢性乙型肝炎患者肝组织和血清TIMP-2
水平对肝纤维化程度的评估 *
朱传龙高人焘李宜赵宗豪聂青和
【摘要】目的了解慢性乙型肝炎患者肝组织和外周血清基质金属蛋白酶组织抑制物-2（TIMP-2）的表达情
况，以进行对肝脏纤维化程度的评估。方法对105 例慢性乙型肝炎患者肝活检组织进行肝纤维化分期。通
过免疫组化技术检测患者肝组织TIMP-2的表达水平， 采用ELISA 法测定患者血清TIMP-2 水平。 结果随着慢
性乙型肝炎患者肝纤维化程度的加重， 肝组织TIMP-2 表达水平逐步上升， 各期之间表达差异有统计学意义
（P<0.05）；与健康对照者比，S 1 耀S 4 期患者血清TIMP-2 水平均升高（P<0. 05） ， 除S1 与S2 期之间无显
著性差异外，其余各期之间TIMP-2 水平有统计学差异。 结论肝组织和外周血TIMP-2 表达水平可以较好地
反映肝脏的纤维化程度。
【关键词】慢性乙型肝炎；基质金属蛋白酶组织抑制物-2；肝活检
The expression of TIMP-2 in liver tissues of patients with chronic hepatitis B ZHU Chuanlong，
GAO Rentao， LIYi， et al. Department of Infectious Disease， Affiliated Provincial Hospital， Anhui
Medical University， Hefei 230001， China[Abstract] Objective To study the expression of tissue
inhibitors of metalloproteinases-2（TIMP-2） in patients withchronic hepatitis B and evaluate its
clinical significance in the diagnosis of hepatic fibrosis. Methods Liver biopsy wasperformed
in 105 patients with CHB，and the expression of TIMP-2 in the liver was detected by
immunohistochemicalstaining. The serum TIMP-2 level in 105 patients and 10 healthy controls was
detected by ELISA. Results The TIMP-2expression in livers increased gradually from liver fibrosis
stage 1 to 4， and the difference of expression was found between different fibrosis stage（P<0. 01） .
Compared with healthy controls，the serum TIMP-2 level in patients with fibrosis
stage 1 to 4 increased markedly（P<0. 05） ， and the difference was found between stage 2 and 3，
and between stage 3 and4（P<0. 05） . Conclusion The expression of TIMP-2 may reflect the fibrosis
stage in CHB patients.
[Keywords] Hepatitis B；TIMP-2；Liver biopsy
肝纤维化是继发于肝脏炎症或损伤后组织修复过程中的代偿反应， 它的发生通常是隐匿性的。 随
着对肝纤维化发生发展以及逆转机制的研究不断深入， 迫切需要一种简便、 可靠和非创伤性的评
价指标 [1] 。 有研究发现， 肝组织基质金属蛋白酶组织抑制物-1（TIMP-1） 和TIMP-2 的过度表达
与肝纤维化的形成密切相关， 而两者的血清水平与其在肝脏的表达强弱具有一定的相关性， 故检
测血清TIMP-1 和TIMP-2 水平可作为诊断肝纤维化较为有用的指标 [2耀5] 。 我们通过肝活检病理检
查将慢性乙型肝炎进行纤维化分期， 再检测各分期患者肝组织和血清TIMP-2水平， 以研究两者的
表达水平与肝纤维化程度的相关性。
资料与方法
一、研究对象2007 年12 月耀2008 年10 月在蚌埠解放军第123 医院和我院确诊的慢性乙型肝炎
患者105例， 男性79 例， 女性26 例， 年龄为18耀72 岁， 平均年龄42依6. 5岁。 按照2000年西安
第十次全国病毒性肝炎和肝病学术会议修订的病毒性肝炎防治方案的标准诊断 [6] 。 另选同期健康
献血员10 例， 男性7 例， 女性3 例， 平均年龄32依8 岁。 所有受试者空腹10耀12h， 晨起抽肘静
脉血3ml， 静置后取上清液， 标本放于-20益保存待检。
二、 血清TIMP-2 的检测采用本室建立的血清TIMP-2 双抗体夹心ELISA 法。 包被液为0. 05M 碳酸
盐缓冲液， pH 9. 6， 将稀释成一定浓度的抗TIMP-2 单克隆抗体（McAb） 分别滴加在96孔聚苯乙
烯板微孔内， 100滋l/孔， 4益过夜， 次日甩尽包被液， 用0. 05%（v/v） Tween -20PBS（PBST） 洗
板3 次， 每次3min； 拍干后加封闭液（含15%小牛血清的PBS） 200滋l/孔， 37益1h， 4益过夜。 次
日弃之， PBST 洗涤3 次， 每次3min。 将标准品及待测血清（其中待测样品用PBS 作1: 100 稀释）
加于包被孔内， 并设阴性对照和空白对照， 37益水浴1h， PBST 洗板5 次， 拍干后加HRP2 抗TIMP-1
或TIMP-2 二抗100滋l/孔， 37益30min， PBST 洗板5 次， 彻底拍干后加入TMB 显色剂， 50滋l/
孔， 37益15min， 加2M H 2 SO 4 50滋l/孔终止反应。 在Elx800 型自动酶标仪
（BIO-TEKINSTRUMENTS. INC） 上测量450nm 处吸光度A 值（OD 值， 以空白对照孔调零） 。 标本
的A值大于或等于临界值（Cut off value） 者为阳性， 反之为阴性。 临界值=2. 1伊阴性对照A 值。
同时通过标准曲线查得待测血清TIMP-2 水平。 本法批内差异（CV） 为4. 19%耀6. 40%， 批间差异
为4. 80%耀8. 10%， 中和抑制率达85%以上， 灵敏度达3ng/ml。
三、 病理学检查采血当日行肝穿刺检查， 采用负压细针活检， 肝组织长度为跃1. 5cm， 用10%中性
甲醛固定， 石蜡包埋， 行连续切片， 常规HE 染色、 网状纤维和Mas原son三色染色。 由解放军第
123 医院病理科做出组织学诊断， 将肝脏纤维化程度分为S 0 耀S 4 期。 其中S 0 期18 例， S 1 期25 例，
S 2 期30例， S 3 期15例， S 4 期17 例。
四、 肝组织TIMP-2 检测分别随机选取S 0 耀S 4 期各5 例肝组织切片， 采用SP二步法检测TIMP-2表
达。 石蜡切片厚4滋m， 常规脱蜡至水， 3豫H 2 O 2 阻断内源性过氧化物酶， 微波加热暴露抗原， 滴
加一抗（1颐100， 武汉博士德公司） ， 4益冰箱过夜， PBS 洗片后滴加二抗（北京中杉公司） ，
37益孵育1 h， DAB 显色3耀5min， 复染、 脱水、 透明、 封片。 随机选取每张切片10 个视野的显
色强度， 经计算机图像灰度扫描数字转换后， 进行半定量分析。
五、 统计学方法采用SPSS11. 5 软件进行统计学处理， P<0. 05为有显著性差异。
结果
一、 肝组织TIMP-2 的表达TIMP-2 在肝脏主要表达于炎症浸润区间质细胞的胞浆； 不同肝纤维化
患者肝组织均能检测到TIMP-2 表达， 但其表达水平随着肝纤维化程度的加重而增加（图1） 。
二、 血清TIMP-2水平与肝组织纤维化程度的关系与健康献血员比， S0 期慢性乙型肝炎患者血清
TIMP-2 水平无明显升高， 而S1耀S4 期患者血清TIMP-2 水平则明显升高（P<0. 05） ； 随着肝纤
维化程度的加重， 患者血清TIMP-2水平有升高的趋势， 除了S1 与S2 期之间无统计学差异以外，
其余各期之间均有统计学差异（图2） 。
讨论
寻找诊断肝纤维化的特异和敏感的非创伤性指标非常重要。 但由于病例选择、 检测方法和试剂等
方面的差异， 已有的一些血清指标在评估肝纤维化程度时常常受到肝脏炎症坏死活动度的影响。
ECM 生成和降解的平衡紊乱可导致ECM 过度沉积， 从而导致肝纤维化 [7] 。 在ECM降解过程中起主
导作用的是基质金属蛋白酶（MMPs） ， 后者是一组锌离子依赖酶， 通过降低胶原螺旋结构的稳定
性， 改变底物的二级结构， 为其他蛋白酶发挥作用创造条件。 而TIMPs是一组具有抑制MMPs 功能
的活性多肽， 通过与MMPs 非共价结合而抑制MMPs 的活性， 也可与酶原结合阻止其活化， 从而抑
制ECM 的降解， 造成ECM 的过度沉积 [8] 。 研究表明， 在已发现的4 种TIMPs 中仅TIMP-1 和2 存
在于肝组织中， 而血清与肝组织TIMP1 和2 存在明显的相关性。 因此， 检测血清TIMP-1 和2 可
作为诊断肝纤维化的有用指标 [9，10] 。 国内外研究表明， 随着肝纤维化程度的加重， 肝组织TIMP-1
和2 基因表达水平增强， 而随着肝纤维化的逆转而下降， 这个过程被认为与炎症程度无关 [11， 12] 。
本资料研究发现， 慢性乙型肝炎患者肝组织均有不同程度的TIMP-2 表达， 主要分布于炎性浸润
区的间质细胞。 根据文献报道， 此类细胞大部分是活化的肝星状细胞（HSC） [13] 。 检测肝组织TIMP-2
的表达水平可以很好地评估肝脏纤维化程度。
在本研究中， 我们利用本实验室建立的ELISA方法检测了患者血清TIMP-2 水平， 结果显示， 与健
康对照组比， 肝炎患者血清TIMP-2 水平均有不同程度的升高， 且随着肝纤维化程度的加重， 血
清TIMP-2 水平有逐步升高的趋势。 然而， S 1 与S 2 期患者血清TIMP-2 水平无明显差异， 说明在纤
维化的早期阶段， 很难通过检测血清TIMP-2水平来进行区分。
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拉米夫定耐药株感染者HBV 基因型和逆转
录酶区变异分析
傅茂英李国云
【摘要】 目的了解拉米夫定耐药株感染者HBV 基因型特征并分析耐药株HBV逆转录酶（RT） 区变异位点和变
异类型。方法应用PCR扩增和直接测序HBV逆转录酶区并与Genebank 中90 株不同基因型野毒株序列进行比
较， 确定54例耐药株感染者HBV 基因型和HBV RT核苷酸的变异特点。 结果在54 例拉米夫定耐药株感染者中，
HBV B基因型占27. 78豫， C 型占70. 37豫， B/C 混合型占1. 85豫； 51 例患者出现RT保守区氨基酸变异（包
括550 和526 位氨基酸变异） ； 18 例患者出现除主型区外HBV RT 非主型区伴随变异；3 例患者未检测到
与拉米夫定相关性变异。 结论拉米夫定耐药株感染者HBV基因型主要为B 型和C 型； 拉米夫定耐药株的氨基
酸变异不仅见于RT 区的526 和550 两个位点， 其他位点以及RT 非保守区也可发生变异。
【关键词】 慢性乙型肝炎； HBV 基因型； 拉米夫定； YMDD 基序变异
The hepatitis B viral genotype and mutations of reverse transcriptase domain analysis in patients
with lamivudine-resistant mutant infection FU Maoying， LI Guoyun. epartment of Infectious
Diseases， The First People’ s Hospital，Kunshan 215300，Jiangsu Province， China
【Abstract】Objective To investigate the hepatitis B viral genotype and mutations of reverse
transcriptase domainin patients with lamivudine-resistant mutant infection. Methods Hepatitis
B virus genotypes in 54 patiens with chronichepatitis B were assayed and HBV reverse transcriptase
sequences were analyzed by PCR and gene sequencing. ResultOut of the 54 patients，15（27. 78
℅were with HBV genotype B， 38（70. 37℅） with genotype C， and 1（1. 85%） with mixedB and C infection；
51 patients had amino acid variation at HBV RT domains （including sites of 550 and 526） ， 18
hadadditional amino acid variation at HBV non-conservative domains and 3 didn’ t have their amino
acid variation detected. Conclusion HBV genotype B and C are the major HBV genotypes in this series
of patients； Lamivudine-resistant HBVstrains may accompany amino acid variation not only in the
sites of 550 and 526 of HBV RT conservative domains， butalso in the non-conserved domains outside
YMDD motif.
【Key words】 Hepatitis B；Genotypes； Lamivudine； YMDD motif
拉米夫定（lamivudine， LAM） 通过与dCTP竞争作用于乙型肝炎病毒（HBV） P 基因逆转录酶（RT）
的催化中心而发挥抗HBV作用 [1] 。 HBV P基因rt区rtM204I/V、 rtM204S变异即YMDD 变异常引起拉
米夫定耐药 [2] 。 近年来， 对YMDD 基序之外变异的研究成为热点。 HBV基因分型有助于解释相同血
清型病毒株感染者的临床表现和预后的差异 [3] ， 便于进行病毒变异与发病机制间关系的探讨。 本
文通过对经拉米夫定治疗后出现HBV 病毒学突破的慢性乙型肝炎（HCB） 患者进行HBV基因测定，
以了解拉米夫定耐药株HBV RT区变异位点和变异类型的特点。
资料与方法
一、 研究对象2006 年12 月至2008 年12 月 在我院诊治经拉米夫定治疗（9～31 个月 ， 中位数为
25 个月 ）后出现HBV 病毒学突破的慢性乙型肝炎患者54 例， 男38 例， 女16 例， 年龄22～55 岁，
平均年龄36. 6±7. 2 岁。 所有病例均符合2000 年西安会议修定的病毒性肝炎防治方案的诊断标
准。 HBV 病毒学突破感染者的入选标准为: （1） 口服拉米夫定100mg/d， 治疗9个月以上； （2）
治疗后曾出现HBV DNA 转阴或HBV DNA 下降大于2lgcopies/ml， 但在继续治疗过程中， HBV DNA 升
高大于1个lg copies/ml； （3） 排除治疗过程中患者依从性差而引起的HBV DNA反跳。
二、 研究方法采用Taq-Man 实时荧光PCR 法定量检测HBV DNA（使用Bio-Rad 公司的Icycler 荧
光PCR仪测定和深圳匹基生物工程技术股份有限公司提供的试剂） ； 采用微粒子酶免疫分析法检
测HBV M（试剂购自上海荣盛生物有限公司） ； 采用厦门百维信公司试剂盒抽提血清HBV DNA。 根
据HBV P基因序列自行设计一对引物， 上游引物S1B:5' -ATGGA GAACATCACATCAGGA-3' （nt157～
177） ； 下游引物Pol-3： 5' -AAGGA TCCAGTTGGC-3' （nt l395～1409） ， 引物由上海申友生物技
术有限公司合成。 PCR反应体积为50μ l， 反应条件是94℃预变性3min； 94℃ 30s， 56℃ 30s， 72℃
45s， 循环35 次， 最后72℃延伸5min。 取PCR 产物5μ l 进行琼脂糖凝胶电泳， 对扩增产物进行
初步鉴定。 阳性的PCR 产物经纯化后， 直接在ABI 377型DNA自动荧光测序仪上进行测序。
三、 统计学方法采用Chromas2. 0 软件对HBVDNA P基因片段核苷酸编码氨基酸的差异和变异类型
进行分析， 采用Clustalxl. 81 . msw软件对HBV 基因型进行分析。 采用SASV6. 0统计学软件对数据
进行统计学处理， 组间率的比较采用x 2 检验， 均值比较采用t检验。
结果
在54 例病毒学突破患者中， 基因型B 型15 例（27. 78％） ， C型38 例（70. 37％） ， B/C混合型1
例（1. 85％） 。 在54 例患者中有51 例患者经HBV DNA 序列分析发现出现有LAM 耐药相关性变异，
即rtM204V/I 变异49 例（96. 08%）， rtL180M 变异例37 例（72. 55%）， rtM204S 变异2例（3. 92%），
另有3例未检测到相关性变异。 54 例患者HBV DNA水平平均为6. 90±1. 32 lg copies/ml， 其中15
例B 型感染患者血清HBV DNA 水平为6. 18±1. 16 lgcopies/ml， 38 例C 型感染患者为7. 19±1. 28
lg copies/ml（P<0. 05） 。 不同P 基因变异感染者HBV 基因型分布和血清HBV DNA水平见表1。 除
了RT 主型区rtM204I/V、 rt L180M 和rt M20S/L变异外， 还发现一些其他的伴随位点突变， 在18
例患者共计有9种类型发生， 见表2。
讨论
HBV 基因型反映了HBV 自然感染过程中的变异特点。确定感染人群中HBV 基因型的分布及基因变
异， 可为乙型肝炎疫苗的改进提供分子流行病学资料， 对于制定有效的乙型肝炎防治方案具有重
要的意义。本研究结果显示本组慢性乙型肝炎患者HBV 基因型分布符合本地区HBV 感染的基本特
点， 即B 型占30. 92%， C 型占67. 76%， B/C混合型为1. 32%。 一般认为， C基因型感染者HBeAg阳性
率明显高于B基因型 [4] ， C基因型HBV更易发生前C区变异 [5] 。
目前， 拉米夫定仍是临床上应用最广泛且有效的抗 HBV 药物， 但长期应用后可诱发 HBV P 基因区
变异， 从而产生耐药， 即所谓的 HBV 病毒学突破（breakthrough） 。 文献报道， 拉米夫定治疗 1
年的耐药率为 16％～32％， 治疗 3～4 年的耐药率可达 49％～66％ [6、 7] 。 HBV 对拉米夫定耐药
主要与 YMDD 基序变异有关， 最常见的变异类型为 rtM204V/I（YMDD） 变异。 YMDD 变异常伴随一
些 RT 区的补偿性变异， 最常见的是 YMDD 基序上游的 rtL180M 变异， 尚有其他伴随变异情况发
生 [8、9] 。 本研究通过分析 HBV P 基因序列， 发现本组拉米夫定耐药相关性以 rtM204V/I（YMDD）
变异为主（96. 08%） ， rtM204S 变异 2 例（3. 92%） ， 72. 55%的变异株伴有 rtL180M 变异， 变异
类型有六种： 即 rtM204I （21. 57%）， M204V （3. 92%）， rtL180M+M204V （43. 14%） ， rtL180M+M204I
（27. 45%） ， rtM204S（1. 96%） 和 rtL180M+rtM204S（1. 96%） 。 既往关于单独 rtM204S 变异导
致拉米夫定耐药的报道甚少。 本研究提示单独 rtM204S 变异即可导致较高水平的病毒学反弹， 应
予重视。 虽然拉米夫定耐药的基因变异多发生于 YMDD 基序， 但长期应用拉米夫定还可诱发其他
部位的基因变异， 如 rtL179P、 rtA181T、 rtP237H、 rtA200V、 rtV207T、 rtS213T、 rtS219P、
rtI224S 及 rtL229V。 因此， HBV P 基因 RT 区变异类型呈多样性。 尽管现在研究认为， 这些部位
的基因变异在拉米夫定耐药性方面意义不大， 但由于 HBV P 基因区含盖了 整个表面抗原多肽
（HBsAg） 编码区， 因此发生于多聚酶编码区的基因变异同样会导致 HBsAg 氨基酸的变化， 从而
出现 HBsAg 抗原性的改变， 这可能影响机体对病毒的免疫应答和清除。 故研究慢性乙型肝炎患
者聚合酶基因的准种复杂性不应该仅仅局限在 P 区， 可应同时考虑到 S 区[10]。 本研究中有 3
例病毒学突破患者经 HBV DNA 测序并未显示 YMDD 等相关变异， 可能是由于基因测序分析方法通
常只检测到优势毒株。 因此， 当 YMDD 变异株只占较小比例时， 用此方法常不能检测到变异株。
有报道采用聚合酶链反应- 限制性片段长度多态性分析较适合 YMDD 变异的早期诊断[11]。
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阿德福韦酯联合拉米夫定治疗YMDD 变异的
慢性乙型肝炎疗效相关因素分析 *
邱源旺蒋祥虎黄利华胡泰洪丁虹蒋跃明戴亚新
【摘要】 目的研究分析影响阿德福韦（ADV） 联合拉米夫定（LAM） 治疗YMDD 变异的慢性乙型肝炎疗效的相
关因素。 方法应用ADV 联合LAM治疗71 例YMDD变异的患者48周， 采用Logistic 回归分析影响疗效的相关因
素。 结果治疗48 周时， HBV DNA 转阴率为78. 9%（56/71） ， ALT 复常率为80. 3%（57/71） ， HBeAg 阳性患
者HBeAg 转阴或血清转换率为26. 7%（12/45） ； 治疗24 周和48 周HBV DNA 转阴、 48 周HBeAg 转阴或血清
转换和48 周ALT 复常者较相应时间点未转阴者的基线HBV DNA 水平低（P约0. 05） ； Logistic 回归分析结
果显示，基线HBV DNA低水平、 24 周HBV DNA 转阴、 12 周YMDD变异转阴是48 周获得较好疗效的相关因素。
结论采用ADV 联合LAM治疗YMDD 变异的慢性乙型肝炎患者，其基线HBV DNA低水平、 24 周HBV DNA 转阴、
12 周YMDD 变异转阴是48 周疗效较好的预测因素， 发生病毒学突破而无生化学突破的患者早期联合治疗可
获得更佳的疗效。
【关键词】慢性乙型肝炎；YMDD 变异； 拉米夫定； 阿德福韦酯
Correlation factors involved in therapeutic efficacy of adefovir dipivoxil in combination with
lamivudine forchronic hepatitis B with YMDD mutation QIU Yuanwang， JIANG Xianghu， HUANG Lihua，
et al. Infectious DiseaseHospital， Wuxi 214000，Jiangsu， China
【Abstract】Objective To investigate the correlation factors associated with the therapeutic
efficacy of adefovir dipivoxil in combination with lamivudine for chronic hepatitis B with YMDD
mutation. Methods 71 patients were enrolledand treated with adefovir dipivoxil in combination
with lamivudine for 48 weeks. Logistic regression analysis was used toidentify some possible
correlation factors associated with therapeutic efficacy. Results After 48 wk treatment， the rate
ofundetectable HBV DNA，ALT normalization and HBeAg seroconversion was 78.9%（56/71） ， 80.3%
（57/71） and 26. 7%（12/45） ， respectively. Patients with undetectable HBV DNA at wk 24 and 48
of the treatment were found to have a lowerbaseline HBV DNA levels as compared with those who
did not respond. Logistic regression analysis indicated that thebaseline HBV DNA levels，
undetectable serum HBV DNA at wk 24， and undetectable serum YMDD mutation at wk 12were correlated
factors of therapeutic efficacy at wk 48. Conclusion Complete response at wk 48 is closely
associatedwith the lower baseline serum HBV DNA levels， HBV DNA negativity at wk 24 and undetectable
serum YMDD mutationat wk 12. Early treatment with adefovir dipivoxil in combination with
lamivudine for the patients with YMDD mutationwithout biochemical breakthrough can reach a better
curative effect.
【Key words】 Hepatitis B；YMDD mutation； Lamivudine； Adefovir dipivoxil
阿德福韦酯（ADV） 对拉米夫定（LAM） 耐药株有较强的抗病毒活性 [1～4] ， 目前已成为拉米夫定耐
药的慢性乙型肝炎临床治疗的主要抗病毒药物之一。 但我们在临床应用中观察到， 部分经LAM 治
疗出现YMDD 变异的患者采用ADV 联合LAM 治疗疗效不佳。 为提高YMDD变异患者的治疗效果， 需
要探索与ADV 治疗疗效相关的影响因素。 为此， 我们总结分析了71 例接受为期48 周ADV联合LAM
治疗的慢性乙型肝炎患者的临床资料， 现报告如下。
资料与方法
一、研究对象2005 年6 月至2007 年6 月在我院门诊和住院的经拉米夫定治疗后出现YMDD变异的
慢性乙型肝炎患者71 例， 男52 例， 女19 例， 年龄26～65岁， 平均年龄37. 6±17. 8岁。 服用LAM
的平均时间为18. 2±5. 8 月， 其中HBeAg阳性45例， HBeAg阴性26例。 HBV基因分型C基因型36例，
B基因型35例。 HBV基因变异为rtM204V+rtL180M43 例， rtM204V+ rtL180M+rtV173L5例，
rtM204I+rtL180M5例， rtM204I18例。 诊断符合慢性乙型肝炎防治指南的标准 [5] 。 排除6 个月内
用过胸腺素α 1、 胸腺五肽和苦参素者， 排除同时感染人类免疫缺陷病毒（HIV） 或感染甲、 丙、
丁和戊型肝炎病毒者， 排除合并酒精性、 自身免疫性或胆汁淤积性肝病或伴有恶性肿瘤、 严重心
脏病等的患者。所有病人均被告知需要长期服药和可能出现病毒耐药等情况， 并签署知情同意书。
二、 治疗方法在继续应用拉米夫定基础上加用ADV（贺维力， 葛兰素史克有限公司） 10mg 口服，
1 次/日， 治疗48 周。
三、 检测方法所有病人治疗前均使用CEQ-8000基因测序仪（美国， 贝克曼库尔特公司） 采用DNA 测
序法检测YMDD 变异（引物由上海生工生物工程公司合成）； 48 周治疗观察过程中采用Lightcycle
基因荧光定量分析法检测YMDD 变异（检测试剂盒由杭州博赛基因诊断技术有限公司提供） ， 对
YMDD 变异检测阳性病例采用DNA 测序法进一步确认； 采用Lightcycle 基因荧光定量分析法检测
HBV DNA、 基因型（HBV DNA 试剂盒购自深圳市匹基工程股份有限公司， 检测灵敏度为
500copies/ml； 基因型检测试剂盒由杭州博赛基因诊断技术有限公司提供） ； 采用1235 时间分
辨荧光免疫分析仪检测HBV 标志物（试剂由苏州新波生物技术有限公司提供） ； 采用日立7600 全
自动生化分析仪及配套试剂检肝功能和肾功能指标。
四、 统计学分析应用SPSS 11. 5 软件进行统计学分析。 正态分布计量资料以均数±标准差表示，
组间比较采用t检验； 非正态分布计量资料以中位数表示， 组间比较采用秩和检验。 率的比较进
行x 2 检验。 应用Logistic 回归分析影响48周疗效的相关因素。 以P＜0. 05为有统计学意义。
结果
一、 治疗48 周时的应答治疗48 周HBV DNA 转阴率为78. 9%（56/71） ， HBeAg阳性患者HBeAg转阴
或转换率为26. 7%（12/45） ， ALT 复常率为80. 3%（57/71） 。
二、 基线ALT 和HBV DNA 水平对24 周和48 周疗效的影响见表1。
三响疗效的相关因素分析见表 2。
四、 早期疗效考核与 48 周疗效的关系见表 3。
讨论
拉米夫定是用于慢性乙型肝炎抗病毒治疗的常用药物之一， 但长期服用出现的耐药变异问题已引
起人们的广泛关注。临床研究显示阿德福韦酯联合拉米夫定治疗可以避免其发生肝炎病情反跳和
降低发生肝功能失代偿的危险性 [6，7] ， 但慢性乙型肝炎的抗病毒治疗是个长期过程， 拉米夫定与
阿德福韦酯联合应用的费用高， 部分患者依从性差。 因此， 研究影响YMDD 变异患者疗效的相关
因素， 以提高疗效就显得很重要。 我们的研究结果提示， YMDD 变异患者在LAM 治疗的基础上加
用阿德福韦酯治疗48 周时， HBV DNA 转阴率、 HBeAg 血清转换率和ALT复常率与年龄、 性别、 YMDD
变异前服用LAM 的时间、 基因型、 YMDD 变异类型等无相关性， 而基线HBVDNA低水平、 12 周YMDD
变异转阴和治疗24 周时HBVDNA 转阴是治疗48 周获得较好疗效的相关因素。 有研究提示， 治疗
前ALT 水平是预测阿德福韦酯初治慢性乙型肝炎及治疗YMDD 变异患者的预测因素 [8～10] ， 但本研
究结果不支持这种说法， 其原因可能是本研究入选患者经拉米夫定治疗出现YMDD 变异后大部分
患者首先表现为HBV DNA 反弹， 而ALT 水平正常或仅轻度升高， 较初治患者基线ALT 水平低。 我
们认为， 患者出现病毒学反弹但血清HBV DNA 水平≤5. 0lgcopies/mL， 且无生化学突破（即
ALT≤1ULN） 时加用ADV 治疗可取得更好的应答。
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糖皮质激素联合生长激素治疗慢加
亚急性肝衰竭临床观察
刘波董静杨家宏刘克万徐宁郭顺明陈从新
【摘要】 目的观察应用糖皮质激素联合生长激素治疗早、 中期慢加亚急性肝衰竭患者的疗效。 方法53 例早、
中期慢加亚急性肝衰竭患者被随机分为常规治疗组（28 例） 、 糖皮质激素治疗组（14 例） 和糖皮质激素
联合生长激素治疗组（11例） 。 结果53. 6%（15/28） 常规治疗组患者死亡， 而21. 4%（3/14） 糖皮质激素治
疗和18. 2%（2/11） 糖皮质激素联合生长激素治疗患者死亡（P<0. 05） ； 糖皮质激素联合生长激素治疗组患
者感染和肝肾综合征的发生明显减少， 血清白蛋白明显升高。 结论在基础治疗的支持下， 应用糖皮质激素
治疗早、 中期慢加亚急性肝衰竭患者可取得一定的效果， 而加用生长激素后可明显减少严重并发症的发生，
提高血清白蛋白水平。
【关键词】 肝衰竭； 慢加急性； 糖皮质激素； 生长激素； 治疗
The effect of glucocorticoid combined with growth hormone in the treatment of patients with
subacute-on-chronic hepatic failure LIU Bo， DONG Jing， YANG Jiahong， et al. Department of Infectious
Diseases， 105 thHospital， Affiliated to Anhui Medical University， Hefei 230031
【Abstract】 Objective To explore the effect of glucocorticoid combined with growth hormone in
the treatment ofpatients with subacute-on-chronic hepatic failure. Methods 53 patients with
subacute-on-chronic hepatic failure wereselected and 14 patients received treatment of
glucocorticoid，11 received glucocorticoid combined with growth hormoneand other 28 received
conventional therapy. Result The survival rate，similar with that in glucocorticoid therapy
（21. 4%） in glucocorticoid combined with growth hormone treatment was 18. 2%， much lower than in
conventional group （53. 6%， P<0. 01） . Conclusion Glucocorticoid combined with growth hormone in
treatment of patients with subacute-on-chronic hepatic failure can effectively decrease the
mortality rate.
【Keywords】Hepatic failure； Subacute-on-chronic；Glucocorticoid；Growth hormone
由于担心糖皮质激素（glucocorticoid， GC） 可能造成出血、 感染、 负氮平衡和病毒复制增加等
原因， 其在治疗慢加亚急性肝衰竭时的应用一直存在争议 [1] 。 我们曾在基础治疗的支持下， 通过
合理的选择应用时机、 剂量和有计划的减量， 成功地阻止了部分慢性乙型肝炎患者进展为重型肝
炎 [2] 。 但毫无疑问， 仍有不少患者病情继续进展或在入院时已经进入肝衰竭状态， 这时皮质激素
的应用就成了争论的焦点。 生长激素（growthhormone， GH） 能增加机体蛋白质的合成， 提高机
体免疫力， 减少肠源性细菌感染， 已被用于治疗肝硬化患者 [3] ， 但有报道它可能增加中性粒细胞
及内毒素的活性， 导致机体损伤的加重 [4] ， 而糖皮质激素可减轻这些副反应 [5] 。 我们尝试将两者
联合应用治疗慢加亚急性肝衰竭早、 中期患者， 取得了一定的效果， 现报告如下。
资料与方法
一、病例选择1999 年～2006年我科收治的慢加亚急性肝衰竭患者53 例（早期14 例， 中期39 例），
男性41例， 女性12 例， 年龄16～73 岁（38. 75±15. 14 岁） 。 诊断符合中华医学会感染病学分
会肝衰竭与人工肝学组和中华医学会肝病学分会重型肝病与人工肝学组联合制定的肝衰竭诊疗
指南 [6] 。 病因诊断为乙型肝炎病毒感染42 例， 乙型肝炎病毒重叠戊型肝炎病毒感染4 例， 乙型
肝炎病毒重叠甲型肝炎病毒感染1 例， 乙型肝炎病毒感染伴酒精性肝炎5例， 乙型肝炎病毒感染
伴药物性肝炎1 例。
二、 治疗方法随机将患者分为3 组， 1 组给予内科综合支持治疗， 包括应用血制品、 预防感染、
预防消化道出血、 减低门脉压、 维持能量代谢和水电解质平衡； 2 组在综合治疗的基础上加用氢
化考的松琥珀酸钠（天津生化制药厂） 100～150mg 静脉滴注， 1 次/d， 维持治疗， 直至患者死
亡， 或黄疸大幅下降（<100μ mol/L） 后逐渐减量； 3组在2 组治疗的基础上加用生长激素（安苏
萌， 安徽安科生物工程股份有限公司） 4U 皮下注射（晚间） ， 1 次/ 日×1月， 再3 次/周×1 月。
三、 观察项目常规检测血生化指标和凝血酶原时间（PT） ， 每2 周复查一次床边B超和胸片。
四、 统计学方法采用x 2 检验和t检验， P<0. 05 为差异有统计学意义。
结果
一、临床症状的改善和转归糖皮质激素治疗组和糖皮质激素联合生长激素治疗组患者在治疗后分
别有11 例（78. 6%） 和9 例（81. 8%） 患者精神状态、 乏力、 腹胀、 纳差、 恶心等症状迅速得到
不同程度的改善， 平均1. 4天， 而内科综合治疗组有13例（46. 4%） 得到改善， 平均7天； 53. 6%
（15/28） 综合治疗组患者死亡， 而21. 4%（3/14， P<0. 05） 糖皮质激素治疗患者死亡， 18. 2%（2/11）
联合两种激素治疗患者死亡， 后两组患者病死率无显著性相差。 各组患者病情转归和并发症发生
情况见表1。
二、 各组患者治疗前后血生化指标变化的比较在内科综合治疗的基础上加用GC 和GC 联合GH 治
疗的患者在治疗1月后血清TBIL 水平均显著降低， 凝血酶原时间缩短， 但GC联合GH治疗患者血浆
白蛋白水平显著升高， 见表2。
讨论
在以往的观念中， 应用糖皮质激素治疗重型肝炎存在很大争议 [1] ， 尤其是用于治疗慢性重型肝炎，
大多持否定态度。 随着内科综合治疗水平的提高， 特别是抗真菌药物、 广谱抗生素和质子泵抑制
剂的临床应用， 糖皮质激素带来的感染、 出血和可能增加的病毒复制的风险得到很大的抑制 [2] 。
而肝衰竭诊疗指南的出台为细化重型肝炎的分型和分期提供了很好的参考， 也为科学的选择病
例， 采取针对性的治疗以提高患者生存率提供了临床依据。 我们在以往应用糖皮质激素阻断慢性
乙型肝炎重度患者进展为肝衰竭经验的基础上 [2] ， 选择部分慢加亚急性肝衰竭患者联合应用糖皮
质激素和生长激素治疗。 结果显示联合治疗组病死率比综合治疗组明显降低（18. 2%对53. 6%， P
＜0. 05） ， 与激素治疗组相当（21. 4%） ， 但感染和肝肾综合征的发生明显减少， 血清白蛋白明
显升高， 显示了良好的应用前景。 GH 作为体内的合成代谢激素， 主要功能是促进机体生长发育
和物质代谢， 还可以增强机体免疫力。 但GH并没有直接促进生长和代谢的作用， 它的这些作用主
要是通过JAK/STAT 途径诱导机体产生的胰岛素样生长因子-1 （IGF-1）来完成的 [7] 。OnenliMungan
等发现， 在败血症和感染性休克的儿童与正常儿童比较， 循环中GH 显著增加， 而IGF-1显著降低
[8] 。 Defalque等发现， 给小鼠注射内毒素后， 小鼠血浆IGF-1以及肝脏的GHR 都迅速下降 [9] 。 Liu
等观察到， 外源性GH 明显增 强了感染诱发的中性粒细胞激活和中性粒细胞在肺部的积聚，肺微血管的
损伤也更加严重， 提示虽然GH 可以提高机体的免疫力， 但过强的免疫反应也可能损害机体自身[10]。 我
们在动物试验中发现肝衰竭早期应用GC可明显降低大鼠血清TNF 水平[5]，可能对改善机体GH 耐受有一
定的帮助， 而理论上GC强大的免疫抑制作用也可减轻外源性GH 引起的机体过强的免疫反应， 避免肝脏进
一步受损。 Huang 等[11]在大肠杆菌诱发的感染性休克小鼠模型上观察到， rhGH 可维护肠道黏膜的完
整性， 减少感染性休克小鼠的内毒素/ 细菌易位， 降低循环中的内毒素水平， 抑制感染诱导的肿瘤坏死因
子-α 释放， 改善循环功能和全身的防御反应。
因此， 在慢加亚急性肝衰竭患者的治疗中， 联合应用GC和GH 可以取长补短， 既能纠正负氮平衡又
能避免过强的免疫反应， 保持肠道黏膜屏障的完整性，从而改善患者的预后。本临床研究的例数较少，有
待于进一步扩大验证。
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CAPS 人工肝治疗肝衰竭的临床研究
董庆华郭利民王宇熊号峰张红宇刘小冬
【摘要】目的应用连续白蛋白净化系统（CAPS）治疗肝衰竭患者，并与分子吸附再循环系统（MARS）进行
比较，观察CAPS 治疗肝衰竭的疗效及安全性。 方法33 例肝衰竭患者在一般治疗的基础上，18 例行CAPS
治疗， 15例行MARS治疗， 比较两组的疗效。结果CAPS 治疗后血清总胆红素由579. 6依136. 3滋mol/L降至473. 3
依96. 3滋mol/L（P约0. 05） 、 肌酐由247. 8依154. 5滋mol/L 降至180. 8依119. 8滋mol/L（P约0. 05） ； CAPS 治
疗组与MARS 治疗组患者痊愈好转率分别为55.5%和53. 3%（P跃0. 05） 。 结论CAPS 能清除毒素， 改善临床症
状和肝功能, 其治疗肝衰竭的疗效肯定， CAPS 具有较优良的性能价格比，适合于我国的国情，值得进一步
探讨、应用。
【关键词】肝衰竭；连续白蛋白净化系统；人工肝；血液净化
Clinical study of continuous albumin purification system in the treatment of patients with liver
failure DONGQinghua，GUO Limin， WANG Yu， et al. ICU， Ditan Hospital， Beijing 100015， China[Abstract]
Objective To evaluate the effect and safety of domestic-made continuous albumin purification
system（CAPS）in the treatment of patients with liver failure. Methods Thirty three patients with
liver failure were enrolled and18 were treated with CAPS and 15 with molecular absorbent recycling
system （MARS） . Results After treating withCAPS， the serum levels of TBIL， TBA，NH3 and Cr decreased
significantly（P﹤05）；The clinical symptoms and signs ofpatients were improved. The survival
rates in CAPS and MARS were 55. 5% and 53. 3%（P﹥. 05） ， respectively. ConclusionThe CAPS may
significantly eliminate albumin-bound and water-soluble substances from the blood， improve
clinical symptoms and liver function.
[Keywords] Liver failure ； Continuous albumin purification system； Artificial liver； Blood
purification
肝衰竭是多种因素导致的肝脏合成、 解毒、 排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿， 出现
以凝血机制障碍、 黄疸、 肝性脑病和腹水等为主要表现的一组临床症候群 [1] ， 病死率仍然较高。
近来， 人工肝技术在肝衰竭治疗方面的作用日益受到重视， 国内已开展了分子吸附再循环系统
（molecular adsorbent recirculating system， MARS） 治疗肝衰竭 [2] 。 但MARS 主机和耗材价
格昂贵, 治疗成本很高, 临床难以广泛应用。我们基于MARS 白蛋白透析的原理， 构建了类似的“连
续白蛋白净化系统” （continuousalbumin purification system， CAPS） ， 该系统用高通量聚
砜膜血滤器替代MARS主透析器， 在白蛋白透析液循环回路中， 采用国产丽珠系列血液灌流器作为
净化白蛋白的吸附介质。 使用CAPS 治疗18 例肝衰竭患者， 现就其临床疗效、 可行性和安全性进
行评估， 报道如下。
资料与方法
一、 病例资料2004 年3 月至2005 年6 月 在我院ICU 住院的肝衰竭患者33 例， 男性24 例， 女性
9 例， 平均年龄为40. 9±9. 6 岁。 肝衰竭病因为乙型肝炎18例， 戊型肝炎1 例， 药物性肝炎7 例，
酒精性肝炎5 例， 中毒性肝炎2例； 急性肝衰竭5 例， 亚急性肝衰竭28 例， 其中早期4 例、 中期
23 例、 晚期6 例， 全部病例均符合2006 年《肝衰竭诊疗指南》 的诊断标准。 将33 例患者分成
CAPS组18例和MARS 组15 例， 两组在年龄、 性别、 临床分型、 分期、 肝功能和并发症等方面具有
可比性。 所有患者治疗前均签署血液净化治疗知情同意书。
二、 治疗方法给予甘利欣、 促肝细胞生长素、 胸腺肽和前列腺素E1等保肝及营养支持治疗， 间断

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